摘要：本文綜述了凝膠層析技術(shù)的定義原理，相關(guān)參數(shù)和實(shí)驗(yàn)操作步驟，以及一般應(yīng)用和優(yōu)缺點(diǎn)等五個(gè)方面。 

關(guān)鍵詞：凝膠層析  原理   參數(shù)  實(shí)驗(yàn)操作流程  應(yīng)用  優(yōu)缺點(diǎn) 

   前言：凝膠層析又稱為分子篩層析或凝膠過(guò)濾。它是以多孔性凝膠填料為固定相，按分子大小順序分離樣品中各個(gè)組分的液相色譜方法。具有分子篩作用的物質(zhì)很多，如浮石、瓊脂、瓊脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝膠等。以葡聚糖凝膠應(yīng)用**廣，商品名是sephadex型號(hào)很多，從G10到G200。凝膠層析技術(shù)廣泛用于生物化學(xué)，高分子化學(xué)等眾多*域。凝膠層析技術(shù)具有設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、分離迅速及不影響分子生物學(xué)活性等優(yōu)點(diǎn)。 （一）凝膠層析原理 

凝膠是一種多孔性的不帶表面電荷的物質(zhì)，單個(gè)凝膠珠本身象個(gè)"篩子”，不同類型凝膠的篩孔的大小不同。當(dāng)帶有多種成分的樣品溶液在凝膠內(nèi)運(yùn)動(dòng)時(shí)，由于它們的分子量不同而表現(xiàn)出速度的快慢，在緩沖液洗脫時(shí)，分子量大的物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，而在凝膠間幾乎是垂直的向下運(yùn)動(dòng)，而分子量小的物質(zhì)則進(jìn)入凝膠孔內(nèi)進(jìn)行“繞道”運(yùn)行，這樣就可以按分子量的大小，先后流出凝膠柱，達(dá)到分離的目的 （二）凝膠層析相關(guān)參數(shù) 

2.1外水體積、內(nèi)水體積、基質(zhì)體積、柱床體積、洗脫體積    外水體積是指凝膠柱中凝膠顆粒周圍空間的體積，也就是凝膠顆粒間液體流動(dòng)相的體積。內(nèi)水體積是指凝膠顆粒中孔穴的體積，凝膠層析中固定相體積就是指內(nèi)水體積。基質(zhì)體積是指凝膠顆粒實(shí)際骨架體積。而柱床體積就是指凝膠柱所能容納的總體積。洗脫體積是指將樣品中某一組分洗脫下來(lái)所需的洗脫液的體積。 2.2分配系數(shù) 

分配系數(shù)是指某個(gè)組分在固定相和流動(dòng)相中的濃度比。對(duì)于凝膠層析，分配系數(shù)實(shí)質(zhì)上表示某個(gè)組分在內(nèi)水體積和在外水體積中的濃度分配關(guān)系。 2.3排阻極限 

排阻極限是指不能進(jìn)入凝膠顆粒孔穴內(nèi)部的**小分子的分子量。所有大于排阻極限的分子都不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，直接從凝膠顆粒外流出，所以他們同時(shí)被**先洗脫出來(lái)。 2.4分級(jí)分離范圍 

分級(jí)分離范圍表示一種凝膠適用的分離范圍，對(duì)于分子量在這個(gè)范圍內(nèi)的分子，用這種凝膠可以得到較好的線性分離。 2.5吸水率和床體積 

吸水率是指1g干的凝膠吸收水的體積或者重量，但它不包括顆粒間吸附的水分。 2.6凝膠顆粒的大小 

層析用的凝膠一般都是球形，顆粒大小通常以目數(shù)（mesh）或者顆粒直徑（m）來(lái)表示。柱子的分辨率和流速都與凝膠顆粒大小有關(guān)。顆粒大，流速快，但分離效果差；顆粒小，分離效果好，但流速慢。一般比較常用的是100-200目。 （三）試驗(yàn)操作流程 

1．凝膠的選擇  根據(jù)層析物質(zhì)分子量的大小選擇不同型號(hào)的凝膠。 

2．凝膠的預(yù)處理  稱取適量的凝膠加入過(guò)量的緩沖液在冰箱（或室溫）中充分膨脹，或在沸水中煮，膨脹時(shí)間應(yīng)根據(jù)不同型號(hào)的凝膠而定。在預(yù)處理的過(guò)程中為使粒子均勻一致需進(jìn)行浮選，即加入凝膠粒子后，輕輕攪拌，靜置20min，傾去沉淀的粒子，如此反復(fù)數(shù)次即可。 3．裝柱  層析柱的選擇一般根據(jù)分離樣品的種類和樣品的數(shù)量而定。純化蛋白質(zhì)時(shí)，柱床體積應(yīng)為樣品體積的25～100倍。去鹽、游離熒光素約為樣品體積的4～10倍。柱太長(zhǎng)或是太短都影響分離效果，而且層析柱的內(nèi)徑和高度應(yīng)有一定的比例。    根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，組別分離時(shí)，大多采用2-30cm長(zhǎng)的層析柱，分級(jí)分離時(shí)，一般需要100cm左右長(zhǎng)的層析柱，其直徑在1-5cm范圍內(nèi)，小于1cm產(chǎn)生管壁效應(yīng)，大于5cm則稀釋現(xiàn)象嚴(yán)重。長(zhǎng)度L與直徑D的比值L/D一般宜在7-10之間，但對(duì)移動(dòng)慢的物質(zhì)宜在30-40之間。 

4. 加樣與洗脫  樣品體積不宜過(guò)多，**好為床體積的1%～5%，**多不要超過(guò)10%。樣品濃度也不宜過(guò)大，濃度過(guò)大粘度大，分離效果差，一般不超過(guò)4%。洗脫液應(yīng)與膨脹一致，否則更換溶劑，凝膠體積會(huì)發(fā)生變化，影響分離效果。洗脫液要有一定的離子強(qiáng)度和pH值。 5．洗脫液收集 樣品加入后打開流出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，當(dāng)樣品液面恰與凝膠床表面相平時(shí)，再加入數(shù)毫升洗脫液中洗管壁，使其全部進(jìn)入凝膠床后，將層析床與洗脫液貯瓶及收集器相連，預(yù)先設(shè)計(jì)好流速，然后分部收集洗脫液，并對(duì)每一餾份做定性、定量測(cè)定。 6．凝膠柱的重復(fù)使用與保存  一次裝柱后可以反復(fù)使用，不必特殊處理，并不影響分離效果。為了防止凝膠染菌，可在一次層析后加入0.02%的疊氮鈉，在下次層析前應(yīng)將抑菌劑除去，以免干擾洗脫液的測(cè)定。   

    如果不再使用可將其回收，一般方法是將凝膠用水沖洗干凈濾干，依次用70%、90%、95%乙醇脫水平衡**乙醇濃度達(dá)90%以上，濾干，再用乙醚洗去乙醇、濾干、干燥保存。濕態(tài)保存方法是凝膠漿中加入抑菌劑或水沖洗到中性，密封后高壓滅菌保存。 （四）凝膠層析的應(yīng)用 

⑴ 脫鹽：高分子（如蛋白質(zhì)、核酸、多糖等）溶液中的低分子量雜質(zhì)，可以用凝膠層析法除去，這一操作稱為脫鹽。本法脫鹽操作簡(jiǎn)便、快速、蛋白質(zhì)和酶類等在脫鹽過(guò)程中不易變性。適用的凝膠為SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6。柱長(zhǎng)與直徑之比為5-15，樣品體積可達(dá)柱床體積的25%-30%，為了防止蛋白質(zhì)脫鹽后溶解度降低會(huì)形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸銨等揮發(fā)性鹽類緩沖液使層析柱平衡，然后加入樣品，再用同樣緩沖液洗脫，收集的洗脫液用冷凍干燥法除去揮發(fā)性鹽類。    #p#分頁(yè)標(biāo)題#e#

⑵ 用于分離提純：凝膠層析法已廣泛用于酶、蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、激素、生物堿等物質(zhì)的分離提純。凝膠對(duì)熱原有較強(qiáng)的吸附力，可用來(lái)去除無(wú)離子水中的致熱原制備注射用水。    

⑶ 測(cè)定高分子物質(zhì)的分子量：用一系列已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)品放入同一凝膠柱內(nèi)，在同一條件下層析，記錄每一分鐘成分的洗脫體積，并以洗脫體積對(duì)分子量的對(duì)數(shù)作圖，在一定分子量范圍內(nèi)可得一直線，即分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定未知物質(zhì)的分子量時(shí)，可將此樣品加在測(cè)定了標(biāo)準(zhǔn)曲線的凝膠柱內(nèi)洗脫后，根據(jù)物質(zhì)的洗脫體積，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出它的分子量。   

 ⑷ 高分子溶液的濃縮：通常將SephadexG-25或50干膠投入到稀的高分子溶液中，這時(shí)水分和低分子量的物質(zhì)就會(huì)進(jìn)入凝膠粒子內(nèi)部的孔隙中，而高分子物質(zhì)則排阻在凝膠顆粒之外，再經(jīng)離心或過(guò)濾，將溶脹的凝膠分離出去，就得到了濃縮的高分子溶液。  （五）凝膠層析技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn) 

1.凝膠層析操作簡(jiǎn)便，所需設(shè)備簡(jiǎn)單。有時(shí)只要有一根層析柱便可進(jìn)行工作。分離介質(zhì)—凝膠完全不需要像離子交換劑那樣復(fù)雜的再生過(guò)程便可重復(fù)使用。 2.分離效果較好，重復(fù)性高。**突出的是樣品回收率高，接近100%。 

3.分離條件緩和。凝膠骨架親水，分離過(guò)程又不涉及化學(xué)鍵的變化，所以對(duì)分離物的活性沒(méi)有不良影響。 

4.應(yīng)用廣泛。適用于各種生化物質(zhì)，如肽類、激素、蛋白質(zhì)、多糖、核酸的分離純化、脫鹽、濃縮以及分析測(cè)定等。分離的分子量范圍也很寬，如SephadexG類為102～105d；Sepharose類為105～108d。 

5.分辨率不高，分離操作較慢。由于凝膠層析是以物質(zhì)分子量的不同作為分離依據(jù)的，分子量的差異僅表現(xiàn)在流速的差異上，所以分離時(shí)流速必須嚴(yán)格把握。因而分離操作一般較慢。而且對(duì)于分子量相差不多的物質(zhì)難以達(dá)到很好的分離。此外，凝膠層析要求樣品粘度不宜太高。凝膠顆粒有時(shí)還有非特異吸附現(xiàn)象。