離子交換樹脂命名 ● ● ● ×● 離子交換樹脂命名 ?強酸性 （001-099） ?弱酸性（100-199） ?強堿性 （200-299) ?弱堿性 （300-399）
（4）色澤：普通凝膠型樹脂是透明的球珠，大孔樹脂呈不透明的霧狀球珠。隨合成原料、工藝條件不同，樹脂的顏色也有所不同，一般有黃、白、黃褐、紅棕等幾種顏色。
動態：離子交換柱，交換、洗脫、再生等步驟均在柱內進行，亦稱為離子交換層析法, 操作連續、交換完全，適宜多組份分離
柱式固定床（Fixed－Bed） 模擬移動床（SMB） 離子交換操作步驟 1 樹脂的選擇 2 樹脂預處理 3 裝柱
4 離子交換吸附 5 洗脫 6 再生
1 樹脂的選擇
2 樹脂預處理
物理處理：水洗、過篩，去雜，以獲得粒度均勻的樹脂顆粒； 化學處理：轉型
陽離子樹脂 酸—堿—酸 陰離子樹脂 堿—酸—堿
**后以去離子水或緩沖液平衡
3 離子交換吸附
? 溶液中待交換離子與樹脂上的活性離子發生交換反應的過程 ? 使盡可能多的待交換離子吸附到樹脂上，同時保證其選擇性
4 洗脫
離子交換完成后，將樹脂吸附的物質重新轉入溶液的方法 洗脫條件選擇原則
? （1） 與吸附條件相反 ? （2） 緩沖液 ? （3） 緩和酸堿 ? （4） 有機溶劑
洗脫一般采取梯度淋洗：先采用洗脫能力弱的溶液，使易洗脫組分流出，然后依次使用洗脫能力更強的溶液，洗脫較難洗脫的組分。
5 樹脂再生
離子交換樹脂(IONRESIN)使用一段時間后，吸附的雜質接近飽和狀態，就要進行再生處理，使之恢復原來的組成和性能
樹脂的再生特性與它的類型和結構有密切關系。
?強酸/強堿樹脂再生比較困難，再生劑量比理論值高相當多； ?弱酸/弱堿性樹脂則較易再生，再生劑量只需稍多于理論值。
?大孔型和交聯度低的樹脂較易再生，而凝膠型和交聯度高的樹脂則要較長的再生反應時
間。
?在實際運用中，為降低再生費用，使樹脂的性能恢復70～80%。再生劑的種類應根據樹脂的離子類型來選用，并適當地選擇價格較低的酸、堿或鹽。
?鈉型陽樹脂可用NaCl溶液再生，用量為其交換容量的2倍 ； ?氫型陽樹脂用強酸再生，鹽酸或硫酸
?氯型堿性樹脂，主要以NaCl 溶液來再生，但加入少量堿有助于將樹脂吸附的色素和有
機物溶解洗出。 #p#分頁標題#e#
?OH型堿陰樹脂則用4%NaOH溶液再生。
腺苷蛋氨酸(SAM)的純化流程 腺苷蛋氨酸(SAM)的純化流程
第五節 凝膠柱層析
利用凝膠層析介質(固定相)交聯度的同所形成的網狀孔徑的大小，在層析時能阻止比網孔直徑大的生物大分子通過。利用流動相中溶質的分子量大小差異而進行分離的一種方法，稱之為排阻層析。
一、凝膠層析的原理
固定相（凝膠）是一種不帶電荷的具有三維空間的多孔網狀結構的物質，凝膠的每個顆粒的細微結構就如一個篩子，小的分子可以進入凝膠網孔，而大的分子則排阻于凝膠顆粒之外，因而具分子篩的性質。又因整個層析過程一般不變換洗脫液，好像過濾一樣，故也稱凝膠過濾。
二、凝膠的種類 1.葡聚糖凝膠 2.瓊脂糖凝膠 3.聚丙烯酰胺凝膠
三、凝膠柱層析的操作與應用
（一）凝膠柱層析的操作特點 1、凝膠柱層析優點：（1）分離條件溫和，因此不易引起生物樣品的變性失活；（2）每次分離操作之后，層析劑無需再生就可重復利用；（3）工作范圍廣，分離的分子質量范圍可從幾百到數百萬；（4）設備簡單，分離機理簡單，易于操作；（5）樣品回收率高，幾乎可達100%。 2、凝膠層析的缺點：凝膠層析上樣量小，操作壓力不能高，流速較慢。
（二）凝膠柱層析的特點與應用 （1）主要用于脫鹽 （2）類分離 （3）分級分離
（4）生物大分子分子量的測定
第六節 疏水層析(hydrophobic chromatography) 利用固定相載體上偶聯的疏水性配基與流動相中的一些疏水分子發生可逆性結合而進行分離的方法，稱之為疏水層析。 一、疏水層析的原理
親水性蛋白質（酶）表面均含有一定量的疏水性基團。盡管在水溶液中蛋白質（酶）具有將疏水性基團折疊在分子內部而表面顯露極性和荷電基團的趨勢，但總會有一些疏水性基團或極性基團的疏水部位暴露在蛋白質（酶）表面。這部分疏水基團可與親水性固定相表面偶聯的短鏈烷基、苯基等弱疏水基會發生疏水性相互作用，被固定相（疏水性吸附劑）所吸附。
二、疏水性吸附劑
各種凝膠過濾介質經偶聯疏水性配基后均可用作疏水性吸附劑。 常用的疏水性配基主要有苯基、短鏈烷基（C3-C8）、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。
三、疏水柱層析的操作與應用
（一）疏水柱層析的操作特點 1、層析柱的制備 2、平衡
3、加樣與洗脫 4、再生
（二）疏水柱層析的特點與應用 1、疏水柱層析特點：（1）疏水柱層析可直接分離鹽析后或高鹽洗脫下來的蛋白質、酶等生物大分子溶液；（2）分辨率很高、流速快、加樣量大；（3）疏水性吸附劑種類多，選擇余地大，價格與離子交換劑相當。
2、疏水柱層析應用：疏水柱層析適用于分離的任何階段，尤其是樣品離子強度高時，即在鹽析、離子交換或親和層析之后用。疏水柱層析主要用于蛋白質類生物大分子分離純化。
第七節 親和層析(affinity chromatography)
在固定相載體表面偶聯具有特殊親和作用的配基這些配基可以與流動相中溶質分子發生可逆的特異性結合而進行分離的一種方法，稱之為親和層析
親和柱層析的原理 一、親和柱層析的原理
（一）配基固定化：選擇合適的配基與不溶性的支撐載體偶聯，或共價結合成具有特異親和性的分離介質；
（二）吸附樣品：親和吸附介質選擇性吸附酶或其他生物活性物質，雜質與層析介質間沒有親和作用，故不能被吸附而被洗滌去除；
（三）樣品解析：選擇適宜的條件，使被吸附的親和介質上的酶或其他生物活性物質解吸
二、親和吸附介質
用于親和層析的理想載體常選用均一的珠狀顆粒，特別是瓊脂糖和交聯葡聚糖，但也用合成的聚丙烯酰胺凝膠、纖維素衍生物、聚苯乙烯和多孔玻璃珠等。 選作配基的分子必須具有適當的化學基團，該基團不參與配基與生物分子的特異結合，但是
卻可以用來連接配基與載體。
將親和配基共價偶聯在載體的表面，即可制得親和吸附介質。一般凝膠過濾介質均可作為親和配基的載體來制備親和吸附介質。
三、親和柱層析的操作與應用
?（一）親和柱層析的操作特點
1．基本過程 （1）進料吸附 （2）雜質清洗 （3）目標產物洗脫 （4）層析柱再生
（二）親和層析的特點與應用 #p#分頁標題#e#
1、親和層析的特點：在生物制品分離和分析*域有寬廣的應用開發前景。由于其具有簡便、快速、專一和高效等特點，親和層析的應用十分廣泛，已普及到生命科學的各個*域。 2、親和層析親和層析的應用： （1）分離和純化各種生物分子 （2）分離純化各種功能細胞
（3）用于各種生化成分的分析檢測
第八節 分配柱層析
一、分配柱層析的基本原理
分配柱層析是利用被分離物質中各成分在兩種不相混溶的液體之間的分配系數不同而使混合物得到分離。
固定在柱內的液體叫固定相，用作沖洗的液體叫流動相。為了使固定相固定在柱內，需要有一種固體來吸牢它，這種固體本身不起什么分離作用，也沒有吸附能力，只是用來使固定相停留在柱內，這種固體叫載體。
進行分離時先將含有固定相的載體裝在柱內，加少量被分離的溶液后，用適當溶劑進行洗脫。在洗脫過程中，流動相與固定相發生接觸，由于樣品中各成分在兩相之間的分布不同，因此向下移動的速度不同，容易溶于流動相中的成分移動快，而在固定相中溶解度大的成分移動就慢，因此得到分離。
二、分配柱層析的載體
（一）硅膠
吸水量為50%時仍為粉末狀，當其吸水量在17%以上時，硅膠就失去其吸附作用，作為載體使用，此時硅膠層析則為分配層析。 （二）硅藻土
具有微孔結構，不具吸附作用，是現在使用**多的載體。其處理和裝柱方法基本同硅膠相似 。
（三）纖維素
三、分配柱層析的固定相與展開劑 （一）固定相
常用的固定相有水、各種緩沖溶液、酸的水溶液、甲酰胺、丙二醇以及為水所飽和的有機溶劑等。有時也采用¡°反相層析法¡±，即用有機溶劑為固定相，而以水或水溶液或與水混合的有機溶劑為流動相。 （二）展開劑
流動相一般用為水所飽和的有機溶劑或水一有機溶劑互溶的混合液，一般常用的流動相溶劑有石油醚、醇類、酮類、酯類、鹵代烷類、苯類等，或它們的混合物。反相層析法常用的流動相，則為正相層析法中的固定相，如水、各種水溶液（包括酸、堿、鹽與緩沖液）、低級醇類等。
三、分配柱層析的基本操作 （一）裝柱
裝柱前，將固定相與載體混合，如果用硅膠、纖維素等載體時，可以直加固定相直接混合，用硅藻土為載體先把硅藻土放在大量流動相液體中，在不斷攪拌下，逐漸加入固定相。 （二）加樣
?1、將被分離物配成濃溶液，用吸管輕輕沿管壁加到含固定相載體的上端，然后加流動相洗脫；
?2、被分離物溶液用少量含固定相的載體吸收，溶劑揮發后，加在層析管載體的上端，然后加流動相洗脫；
?3、用一塊比管徑略小的圓形濾紙吸附被分離物溶液，溶劑揮發后，放在載體上，然后加流動相洗脫。
四、分配柱層析的特點與應用
（一）特點：
分配柱層析具有載體來源容易、分離成本低、流速快等特點,適用于分離極性比較大、在有機溶劑中溶解度小的成分，或極性很相似的成分。 （二）應用：
分配柱層析多用于分離親水性的成分，如苷類、糖及氨基酸類。
實驗十 胡蘿卜素的柱層析分離 一、實驗準備
（一）實驗原理及目的 1、原理
本實驗采用氧化鋁為固定相的吸附層析。各種物質具有不同的吸附力， 胡蘿卜素存在于胡蘿卜、辣椒等黃綠色植物中，由于在動物體內可將胡蘿卜素轉變為維生素A，故又稱維生素A原。胡蘿卜素（屬多烯色素類，又可分為α、β、γ等幾種類型）可用乙醇、石油醚和丙酮等有機溶劑從食物中提取出來，并能被氧化鋁所吸附。由于胡蘿卜素與其他植物色素的化學結構不同，它們在有機溶劑中的溶解度以及被氧化鋁吸附的強度也不相同，故將抽提液進行氧化鋁柱層析，再用石油醚等沖洗層析柱，即可將植物提取液中混合的胡蘿卜素分離成不同的色帶。同植物其他色素相比較，胡蘿卜素的極性**小，吸附**差，用石油醚洗脫速度**快，故被**先洗脫下來，使胡蘿卜素與其他色素分開。同時也可將胡蘿卜素層析帶洗脫下來進行比色定量。
2、目的
（1）了解柱層析的基本原理
（2）掌握胡蘿卜素分離的操作方法 （二）試劑及器具 1、材料
新鮮紅辣椒、氧化鋁（Al2O3，高溫烘烤除去水分，提高其吸附力） 2、試劑
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95%乙醇、無水硫酸鈉、石油醚（沸點60～90℃）、1%丙酮-石油醚液（丙酮：石油醚=1：1；體積比）、三氯化銻氯仿溶液（稱取三氯化銻22g，加100ml氯仿溶解后，貯于棕色瓶中）。 3、器具
剪刀、研缽，層析柱（1cm×16cm）,100ml分液漏斗，量筒100ml，鐵架臺及蝶形夾，蒸發皿，恒溫水浴，天平，燒杯、軟木塞、棉花、膠頭滴管、濾紙、試管 二、實驗過程
乙醇 石油醚 蒸餾水 硫酸鈉
紅辣椒 研磨 研磨 洗滌 提取液 除水 上樣 層析 收集洗脫液 鑒別 三、注意事項
（一）實驗中一定要將新鮮紅辣椒研細，以徹底破壞植物細胞，使胡蘿卜素釋放更完全。丙酮可增強分離效果，有利于對胡蘿卜素的提取，若分離條件控制得好，可依次提取、分離得到α胡蘿卜素，ß胡蘿卜素、γ胡蘿卜素，以及緊隨其后的是辣椒紅素，番茄紅素及葉黃素等植物色素。
（二）為使分離色帶整齊，裝柱時層析柱一定要無裂縫和氣泡，氧化鋁的高度一般為玻璃柱高度的3/4，裝好柱后柱上面覆一層濾紙，以保持柱上端頂部平整，若上端不平，影響分離效果而產生不規則的條帶。
三）分離洗脫過程中，要連續不斷加入洗脫液，并保持一定高度的液面，在整個操作中jue不能使氧化鋁表面的液體流干。
（四）三氯化銻腐蝕性較強，在實驗過程中切勿觸及皮膚。三氯化銻遇水生成堿式鹽，再轉變成氯氧化銻，此化合物與胡蘿卜素不發生顏色反應，而出現渾濁。
（五）石油醚提取液中的乙醇必須洗凈，否則吸附不好，層析中色帶也彌散不清。 （六）層析柱底部棉花的用量不宜過多，松緊要適宜，否則將影響流速。
實驗十一 離子交換色譜分離混合氨基酸 一、實驗準備
（一）實驗原理及目的 1、原理
本實驗采用磺酸型陽離子交換樹脂分離酸性氨基酸天冬氨酸（Asp，pI=2.97，分子量為133.1）和堿性氨基酸賴氨酸（Lys，pI=9.74，分子量為146.2）的混合液。在pH=5.3條件下，因為pH值低于Lys的pI值，Lys可解離成陽離子結合在樹脂上；Asp可解離成陰離子，不被樹脂吸附而流出層析柱。在pH=12條件下，因pH值高于Lys的pI值，Lys可解離成陰離子從樹脂上被交換下來。這樣，通過改變洗脫液的pH值可使它們被分別洗脫而達到分離的目的。2、目的
(1)、了解離子交換樹脂分離氨基酸基本原理 (2)、掌握陽離子交換樹脂處理技
（二）試劑及器具 1、材料
磺酸型陽離子交換樹脂（732型） 2、試劑
樹脂處理液：2mol/LNaOH、2mol/L HCL、1mol/L HCL、1mol/L NaOH、0.45mol/L檸檬酸緩沖液（pH=5.3）、0.01mol/LNaOH緩沖液（pH=12）、天冬氨酸、賴氨酸、茚三酮、無水乙醇。 3、器具
離子交換色譜柱、量筒、吸管、收集器、試管、
恒流泵。 二、實驗過程
樹脂處理、轉型 裝柱 平衡 上樣 洗脫 收集 測定
三、注意事項
（一）為使分離色帶整齊，裝柱時層析柱一定要無裂縫和氣泡。
（二）分離洗脫過程中，要連續不斷加入洗脫液，并保持一定高度的液面，在整個操作中jue不能使樹脂表面的液體流干。
（三）一直保持流速10滴/min～12滴/ min，并注意勿使樹脂表面干燥。
實驗十二 凝膠柱層析分離蛋白質 一、實驗準備
（一）實驗原理及目的 1、原理： 凝膠層析（gel chromatography）是利用某些凝膠對于不同組分因分子大小不同而阻滯作用不同的差異而進行分離的技術。當溶液在層析柱內流過時，各種物質分子在柱內同時進行向下的移動和不定向的分子擴散運動。大分子物質由于分子直徑大，難于進入凝膠顆粒的微孔，只能在凝膠顆粒的間隙中隨流動相快速向下移動；而小分子物質能夠擴散進入凝膠顆粒的微孔中，因此在流動過程中不斷地進出于膠粒的微孔，這樣就使小分子物質向下移動的速度落后于大分子物質，從而使溶液中的各組分按分子量從大到小的順序先后流出層析柱，達到分離純化的目的。 #p#分頁標題#e#
本實驗主要學習葡聚糖凝膠柱層析分離（凝膠過濾）的基本操作技術環節，如柱層析填充介質（凝膠）的溶脹、裝柱、平衡、洗脫等。
?2、目的：
（1）熟悉凝膠層析分離的基本原理；
（2）掌握凝膠柱層析填充物的裝柱、平衡、加樣、洗脫等基本操作技術 ?（二）試劑及器具 1、材料 Sephadex G-50（或G-75）、藍色葡聚糖2000、牛血清蛋白 2、試劑
磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、0.1mol/L磷酸鹽緩沖液。
緩沖液的配制方法：先稱取一定量的磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀，用去離 子水分別溶解、配制成3L濃度為0.1mol/L的溶液，然后將這兩種溶液邊按一定比例混合，邊用酸度計檢測，調配成pH7.0的磷酸鹽緩沖液 3、器具
酸度計、層析柱（1.6cm×30cm）、鐵架臺、試管（多個）紫外分光光度計或
紫外檢測儀、電爐、容量瓶（1L）、燒杯、三角瓶、滴管、移液管、電子天平、玻棒、塑料壺（3~5L）。 二、實驗過程
凝膠溶脹 裝柱 平衡 加樣 洗脫 繪制曲線 三、注意事項 ?（一）層析柱大小可根據實際需要選擇，一般來說，細長的柱分離效果較好。若樣品量多，**好選用內徑較粗的柱，但此時分離效果稍差。柱管內徑太小時，會發生管壁效應，即柱管中心部分的組分移動慢，而管壁周圍的移動快。柱越長，分離效果越好，但柱過長，實驗時間長，樣品稀釋度大，分離效果反而不好。
?（二）裝好的層析柱凝膠要均勻，不能有斷層或紋路或氣泡，將柱管對著光照方向觀察，若層析柱床不均勻，必須重新裝柱。
?（三）各接頭不能漏氣，連接用的小乳膠管不要有破損，否則造成漏氣、漏液。操作過程中，層析柱內液面不斷下降，則表示整個系統有漏氣之處，應仔細檢查并加以糾正。
?（四）始終保持柱內液面高于凝膠表面，否則水分揮發，凝膠變干。也要防止液體流干，使凝膠混入大量氣泡，影響液體在柱內的流動，導致分離效果變差，不得不重新裝柱。 ?（五）洗脫用的液體應與凝膠溶脹所用液體相同，否則，由于更換溶劑引起凝膠容積變化，從而影響分離效果。
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